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基因毒性雜質(zhì)的分析色譜柱方法案例

基因毒性雜質(zhì)能直接作用于人體中的 DNA，造成 DNA 損傷而具有致癌、致畸或致突變的性質(zhì)。

少量的基因毒性雜質(zhì)也能對人體造成極大的損害，對基因毒性雜質(zhì)的研究已引起了藥物研究者的廣泛關(guān)注。

1、定量分析

由于基因毒性雜質(zhì)危險性極大，美國 FDA 和歐洲藥品管理局(EMA)規(guī)定了毒理學(xué)擔(dān)憂閾值(TTC):人在長期用藥時，潛在毒性雜質(zhì)每日攝入量不能超過 1.5 μg 。

根據(jù)上述規(guī)定，每天藥物服用劑量是 200mg，則毒性雜質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)不應(yīng)超過7.5-×10^-6 ，因此對基因毒性雜質(zhì)定量分析需要痕量分析的方法。

常用的紫外檢測器最低能夠?qū)|(zhì)量分數(shù)5×10^-4的雜質(zhì)進行檢測，但隨著 2D-HPLC的發(fā)明以及高靈敏度紫外檢測器的使用，藥物中痕量雜質(zhì)經(jīng)一維液相儀分離、固相萃取技術(shù)富集及二維液相儀高靈敏度檢測也能實現(xiàn)準(zhǔn)確定量。

但是，這種方法需要多次高濃度進樣并不適合雜質(zhì)含量測定。

因此，質(zhì)譜檢測技術(shù)是建立基因毒性雜質(zhì)定量分析方法的重要前提。Kakasaheb等對坎地沙坦中合成起始原料中的基因毒性雜質(zhì)利用 GC-MS 的方法進行定量測定，方法學(xué)驗證結(jié)果能夠符合 ICH 規(guī)定的要求，該方法適用于上市藥品中基因毒性雜質(zhì)的含量測定。

在痕量的雜質(zhì)進行方法建立過程中，樣品的前處理方式十分重要，微量的損失可能對結(jié)果造成極大的影響，Devenport 等創(chuàng)新性地在大氣壓條件下利用質(zhì)譜直接定量出模擬藥物中基因毒性雜質(zhì)，這種方法使樣品測定更加便捷，并可實現(xiàn)對藥物的高通量檢測。

2、毒性雜質(zhì)的確定

2006 年，EMA 發(fā)布了遺傳毒性限度的指導(dǎo)原則，此后 ICH、FDA 以及我國的藥品審評中心也提出了對基因毒性雜質(zhì)的研究和控制方案。根據(jù)相關(guān)的指導(dǎo)原則，即使雜質(zhì)的含量在規(guī)定的定量要求以下也需要對雜質(zhì)進行毒性評估。

對化合物毒性評估是通過體外細菌毒性實驗實現(xiàn)的，同時指導(dǎo)原則推薦使用雜質(zhì)單體進行研究。然而，藥物中的毒性雜質(zhì)都是微量或痕量存在的，通過制備等方法獲取雜質(zhì)單體耗時長且成本高。

為此，F(xiàn)DA 和其他公司共同開發(fā)了計算機軟件用于評估化合物的毒性。此軟件無需獲取單體，對雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行鑒定后，即可使用毒性評估軟件評估雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)是否存在警示結(jié)構(gòu)。

在軟件方面，F(xiàn)DA 推薦使用MC4PC、MDL-QSAＲ以及 Derk for Window 等進行評估。為了對毒性得以準(zhǔn)確性的評估，每種軟件擁有特殊的算法和適用范圍：

MC4PC軟件是將待評估的結(jié)構(gòu)拆分成 2~3 個(非氫)原子的結(jié)構(gòu)碎片，再將這些碎片與已知毒性化合物碎片數(shù)據(jù)庫進行比對，對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)中的碎片做出了毒性累加得分并描繪結(jié)構(gòu)的分子特征，最終生成一個全面而且專業(yè)的報告評估雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)毒性。

雖然 MC4PC能夠從雜質(zhì)的精細結(jié)構(gòu)角度評估藥物的毒性，但是其只能在已有的數(shù)據(jù)庫中搜索相同的碎片進行比較，對多于一種未知碎片的結(jié)構(gòu)卻不能全面評估。

毒性化合物的研究結(jié)果表明毒性化合物結(jié)構(gòu)中都存在著親電子基團或可被激活為親電子基團的結(jié)構(gòu)，MDL-QSAＲ毒性評估軟件是基于化合物的毒性和該化合物的親電能力的相關(guān)性做出評估，這種軟件可計算出化合物結(jié)構(gòu)與其毒性的定量關(guān)系，同時可以預(yù)測體外細菌毒性實驗的結(jié)果。

然而，為了達到對已知結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)毒性的最準(zhǔn)確評估，使用 MDL-QSAＲ軟件時需尋找到最適合的模型用以計算，因此在該計算軟件提出后，有許多關(guān)于不同的數(shù)據(jù)模型以及對它們的評估的報道。

有些雜質(zhì)雖經(jīng)計算機評估結(jié)果為有警示結(jié)構(gòu)的潛在毒性雜質(zhì)，但由于評估軟件在計算過程中會過分評估雜質(zhì)的毒性，所以在判定藥物雜質(zhì)是否為毒性雜質(zhì)仍需要進行體外細菌回復(fù)突變實驗(Ames 實驗)或哺乳動物細胞分析，F(xiàn)DA對該實驗的過程給予詳細的說明。

3、控制方法

根據(jù) EMA 指導(dǎo)原則以及對指導(dǎo)原則問題解答，藥物中所有存在的化合物均應(yīng)該通過化合物毒性評估或符合指導(dǎo)原則的控制方法，同時為了確定潛在毒性雜質(zhì)是否為毒性雜質(zhì)需要進行Ames實驗。

展望

雜質(zhì)研究在藥物研發(fā)過程中占有及其重要的地位，不僅影響著新藥上市的速度，更影人類用藥安全。隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，雜質(zhì)研究的策略已經(jīng)變得愈發(fā)多樣化。隨著檢測器分辨率以及靈敏度的提高，雜質(zhì)定量實現(xiàn)了由微量到痕量的飛躍，雜質(zhì)的定性工作也實現(xiàn)了由離線到在線檢測的轉(zhuǎn)變。然而，新藥研發(fā)速度的加快，生物藥物的不斷涌現(xiàn)以及快速定性定量分析的要求，將給研究人員帶來極大的挑戰(zhàn)。